Implantation d’une sonde biocompatible flexible dans un modèle murin de glioblastome

Résumé

Source : Lefevre, M. C., et al., Dispositifs électroniques organiques flexibles pour la thérapie par champ électrique pulsé du glioblastome. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’implantation d’une sonde flexible et biocompatible dans un modèle de souris atteinte de glioblastome pour administrer une thérapie ciblée par champ électrique pulsé pour des applications neurothérapeutiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Le modèle in vivo
   NOTE : Souris adultes fluorescentes multicolores AMU-Neuroinflam (B6. Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) ont été utilisés ; ces souris présentent le marquage d’une sous-population de neurones Thy1⁺ par l’expression transgénique de l’ECFP, le marquage des cellules inflammatoires périphériques LyzM⁺ par l’expression transgénique de l’EGFP et le marquage d’un sous-type de microglie exprimant l’EYFP sous le contrôle de Cd11c⁺. En bref, les animaux sont légèrement sédatés avec de l’isoflurane à 1,5 % pendant 2 minutes avant tout traitement ou injection. Avant l’opération, les animaux sont anesthésiés avec de la kétamine (120 mg/kg ; IP) et la xylazine (12 mg/kg ; IP). Ensuite, un gel de lidocaïne à 3 % est appliqué localement pour soulager toute douleur dans les oreilles associée à la fixation du support stéréotaxique. Ensuite, une solution de bupivacaïne à 0,25 % est administrée au site chirurgical pour soulager toute douleur due à la craniotomie. Une fois la souris préparée pour l’opération, une craniotomie de 4 mm de diamètre a été réalisée. Avec une aiguille de 26 G, un trou a été fait dans la dure-mère au milieu de la craniotomie, et le sphéroïde tumoral a été injecté avec le système d’injection. De plus, comme décrit ici, une électrode flexible a été placée sur le sphéroïde tumoral exprimant le GCamp6 ou le DsRed avant de sceller la craniotomie avec une fenêtre en verre.
   1. Place une goutte de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) de manière à ce qu’elle recouvre la craniotomie. Placez l’électrode flexible sur la goutte de DPBS et placez doucement l’arrière de la sonde avec des coussinets de contact sur le dos de la souris (Figure 1B).
      REMARQUE : utilisez des gants stériles et une technique de « pointe uniquement ». Changez les gants si vous entrez en contact avec une surface non stérile. Fournir un soutien thermique pendant cette procédure.
   2. Touchez la goutte DPBS avec un petit morceau de papier pour absorber le DPBS jusqu’à ce que la sonde puisse reposer à plat sur la dure-mère et suivre la courbure du cerveau. Assurez-vous qu’une petite couche de DPBS reste sous les électrodes sans s’échapper du côté de l’électrode. Cela garantit une barrière contre le débordement de colle lors des étapes suivantes.
      REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation.
   3. Placez une petite goutte d’adhésif silicone sur la sonde et couvrez-la d’un verre de protection rond de 5 mm. Poussez le verre de protection vers le bas jusqu’à ce que le silicone soit uniformément réparti et que la distance entre le verre de protection et la sonde soit minimale. Poussez le verre de protection vers le bas pendant encore 30 secondes pour que le silicone puisse se solidifier.
   4. Pour fixer le verre de protection, appliquez rapidement de la superglue sur ses côtés et poussez-la vers le bas jusqu’à ce que la colle durcisse et devienne solide.
   5. À l’aide d’un cure-dent, appliquez de la superglue sur le cou de la sonde, en prenant soin que la superglue soit tirée sous le cou pour lui fournir un support stable.
   6. Couvrez le crâne avec du ciment dentaire pour construire un capuchon chronique. Prenez soin de ne couvrir que les bords de la vitre de protection.
   7. Soulevez l’arrière de la sonde et appliquez du ciment sous son cou. Posez la sonde sur le ciment avant qu’il ne durcisse. Appuyez doucement sur le col de la sonde à l’aide d’une pince émoussée afin que sa surface soit au même niveau que celle du verre de protection et non dans le chemin de l’objectif du microscope pendant l’expérience.
   8. Couvrez le haut du col de la sonde avec pas plus de 1,5 mm de couche de ciment dentaire pour obtenir un maintien ferme sur la sonde. Construire un puits en ciment présentant une crête de 1,5 mm à une distance de 1 à 2 mm autour du verre de couverture pour créer un bassin pour le fluide d’immersion pour l’imagerie à deux photons (Figure 1C).
   9. Une fois le ciment durci, appliquez des analgésiques post-chirurgicaux à base de buprénorphine (0,05 mg/kg, 0,1 mL pour 10 g de poids corporel par voie sous-cutanée) et maintenez l’animal dans une atmosphère chaude jusqu’à ce qu’il se réveille. Cela inclut la proximité d’une ampoule infrarouge ainsi que l’emballage de l’animal dans une serviette en papier.
      REMARQUE : Placez un thermomètre au niveau de la souris pour surveiller la température.
   10. Caractérisez l’impédance dans la gamme 1-10 kHz à l’aide d’un potentiostat.
   11. Laissez l’animal se remettre de la chirurgie pendant au moins 10 jours. Administrer des anti-inflammatoires immédiatement après la chirurgie et continuer à surveiller l’état de l’animal pour fournir une analgésie postopératoire appropriée.

Résultats

Figure 1 : L’application in vivo. A) Plan d’expériences in vivo. (B) Placement de la sonde avant l’application du verre de couverture et de la résine acrylique. (C) Implantation de la s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Résine acrylique	Fischer scientific	NC1455685
Buprenorphine	Axience
Streptomycine	Gibco	15140-122
Tampon phosphate Solution saline	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
Verre de couverture rond 5 mm de diamètre	Fischer scientific	50-949-439
Adhésif silicone Kwik-Sil	World Precision Instruments
Super colle	Office depot
U87-MG	ATCC	HTB-14	Cellules de glioblastome humain

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